Etichetta

Jul 09, 2023

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 12619 (2023) Citare questo articolo

282 accessi

10 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

Una strategia per combattere la resistenza antimicrobica è la scoperta di nuove classi di antibiotici. La maggior parte degli antibiotici ad un certo punto interagirà con la membrana batterica per interferire con la sua integrità o per attraversarla. Strumenti affidabili ed efficienti per determinare la costante di dissociazione per il legame di membrana (KD) e il coefficiente di ripartizione tra le fasi acquosa e di membrana (KP) sono quindi strumenti importanti per scoprire e ottimizzare i risultati antimicrobici. Qui dimostriamo che la termoforesi su microscala (MST) può essere utilizzata per la misurazione senza etichetta della KD utilizzando la fluorescenza intrinseca del triptofano ed eliminando così la necessità di etichettatura del cromoforo. Come prova di principio, abbiamo utilizzato il metodo per misurare il legame di un insieme di piccoli AMP ciclici a grandi vescicole unilamellari (LUV) e due tipi di nanodischi lipidici assemblati da stirene acido maleico (SMA) e ammonio quaternario SMA (SMA-QA ). I valori KD misurati si correlano bene con le misurazioni corrispondenti utilizzando la risonanza plasmonica di superficie (SPR), riflettendo ampiamente anche la concentrazione minima di inibizione (MIC) degli AMP testati nei confronti di S. aureus ed E. coli. Concludiamo che MST è un metodo promettente per il rilevamento rapido ed economico delle interazioni peptide-lipide o per la mappatura delle condizioni del campione in preparazione per studi più avanzati che si basano su costosi tempi di preparazione, etichettatura e/o strumento.

I peptidi antimicrobici (AMP) hanno attirato sempre più attenzione come fonte di ispirazione per combattere l’incombente crisi della resistenza antimicrobica mentre la scoperta di nuove classi di antibiotici si è fermata1. Gli AMP sono una classe di peptidi dotati di attività antimicrobica, sebbene siano noti anche per possedere alcune proprietà antifungine e antitumorali2,3. Sono tipicamente peptidi cationici corti di circa 12-50 aminoacidi, con almeno 4 residui necessari per l'attività4. Presenti nella maggior parte degli organismi viventi, sono componenti naturali e indispensabili delle difese immunitarie innate5,6,7,8. Attualmente, più di 20.000 sequenze peptidiche con proprietà antimicrobiche sono pubblicate in archivi dedicati9,10,11,12,13, fornendo un pool di potenziali candidati terapeutici. La modalità d'azione antimicrobica della maggior parte degli AMP sembra essere quella di colpire l'integrità e/o il potenziale elettrico del doppio strato di membrana, o di avere bersagli multipli e combinazioni di modalità d'azione, qualcosa che rende più difficile lo sviluppo della resistenza e comporta un effetto negativo. costi di fitness più elevati da mantenere. Con alcune eccezioni, questo contrasta con gli antibiotici tradizionali, che di solito hanno un bersaglio ben definito. Un secondo vantaggio degli AMP è che non è necessario attraversare interamente la membrana, poiché i peptidi attivi di membrana spesso esercitano la loro attività distruggendo, permeabilizzando o lisando la membrana batterica stessa14,15.

L'affinità dell'AMP verso le membrane batteriche è spesso descritta in due modi: come un evento legante che può essere descritto tramite la costante di dissociazione KD16; oppure come un sistema bifasico, dove l'interazione dell'AMP con i lipidi è vista come un partizionamento tra una fase lipidica e una fase acquosa, caratterizzata dalla costante di partizionamento KP17. Sia KD che KP sono quindi descrittori utili per lo screening dei composti in base alle loro interazioni con la membrana batterica bersaglio.

Gli attuali metodi utilizzati per valutare l’affinità lipidica presentano in genere numerosi svantaggi. Potrebbero non essere applicabili a legami più forti (NMR)18, richiedere un'etichettatura che influisca sul legame (test di fluorescenza)19, richiedere molto tempo (NMR e SPR)20,21, richiedere grandi quantità di campioni (NMR) o richiedere una messa a punto per ogni singolo composto (SPR e ITC)20,21. La termoforesi su microscala (MST) è un metodo che non presenta questi svantaggi22. È uno strumento semplice ma potente, che consente la determinazione dei parametri di legame mediante l'osservazione degli effetti del legame su un fluoroforo e sulle relative proprietà termoforetiche dei complessi formati. I legami si ottengono monitorando i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza di un complesso nel tempo dopo l'esposizione a un laser IR. Il laser riscalda una serie di campioni con diverse concentrazioni di ligando, provocando una ridistribuzione delle molecole in base alle loro relative energie di Gibbs in soluzione alle diverse temperature (termoforesi). I cambiamenti nella fluorescenza dovuti agli effetti di legame del ligando vengono monitorati durante il riscaldamento e il nuovo raffreddamento. Il metodo è sensibile ai cambiamenti nella piega, nella forma, nel guscio di solvatazione, nella carica o nella dimensione complessiva del complesso legato al ligando. Questi cambiamenti possono influenzare l'ambiente locale di un fluoroforo alterando il quenching dinamico e statico, nonché le proprietà termoforetiche del complesso, e rendere MST sensibile a cambiamenti potenzialmente minori nelle proprietà che derivano dal legame23. La MST è attualmente utilizzata principalmente per valutare le interazioni biomolecolari, compreso il legame dei ligandi a vari substrati22 e la polimerizzazione24. Una precedente applicazione correlata di MST di Yu et al. ha valutato il legame di un AMP utilizzando l'etichettatura FITC25. L'MST può essere eseguito utilizzando l'etichettatura con fluoroforo o senza etichetta, sfruttando amminoacidi intrinsecamente fluorescenti come W, Y e F. La quasi ubiquità di W in molti AMP offre l'opportunità di studiare le proprietà di legame dell'AMP direttamente utilizzando la fluorescenza intrinseca di W Ulteriori importanti vantaggi dell'MST sono i bassi requisiti di campionamento, i brevi tempi di misurazione e la semplice configurazione sperimentale20,21,26.